مقدمه‌ای بر بیوتكنولوژی انتقال ژن در ماهی

مقاله مقدمه‌ای بر بیوتكنولوژی انتقال ژن در ماهی در 50 صفحه ورد قابل ویرایش

مقدمه‌ای بر بیوتكنولوژی انتقال ژن در ماهی

بخش اول: دست كاریهای ژنی در ماهیان

مقدمه:

یكی از زمینه های كه امروزه بیوتكنولوژیست ها روی آن تحقیق می كنند ایجاد گونه های ترانسژنیك است. طبق تعریف ترانسژنیك موجودی است كه، دارای DNA  نو تركیبی باشد. به طوری كه در ژنوم آن موجود ژن نو تركیب بیان می شود. بیان ژن خارجی یكی از جنبه های تولید ترانسژنیك و انتقال DNA به زاده های  هدف بعدی می باشد. در این زمینه تكنیك میكرواینجكش در انتقال ژن به تخم مهره داران اولین بار به وسیله گوردون (Gordon) و همكاران در سال 1980 گزارش شد. در این تكنیك یك لوله مؤئین شیشه ای را برای وارد كردن DNA نو تركیب به پیش هسته نریا با سیتوپلاسم تخم لقاح یافته موش به كار گرفتند. در همین سال میكروانجكش مستقیم DNA نو تركیب در شرایط آزمایشگاهی جهت ایجاد حیوانات ترانسژنیك مورد استفاده قرار گرفته است. طوری كه ژن را از این طریق وارد تخم های لقاح نیافته یا لقاح یافته موجوداتی نظیر جنین توتیای دریایی،‌ موش،‌ قورباغه، مگس سركه، خرگوش و خوك كرده اند (Brem 1988) در سال 1985 زئو (Zhu) و همكاران ژنی شامل پرتومتالوتیونین موش و ژن هورمون رشد انسانی را به ناحیه مركزی صفحه زایای تخم های لقاح یافته ماهی طلایی تزریق كردند و قسمتی از این ژن را در DNA ماهیان مشاهده كرند. در همین سال روكونس (Rokkones) تكنیك میكرواینجكشن دو مرحله ای بر روی تخم آزاد ماهیان را شرح داده است. در این تكنیك ابتدا به كمك یك وسیله نوك تیز فلزی در قطب حیوانی سوراخی ایجاد شده و از طریق این سوراخ محلول حاوی DNA  نو تركیب به كمك پی پت ریز تخم شدند به طوری كه به كیسه زرده وارد نشوند. پس از 14 روز پلاسمیدهای كامل را مشخص كردند. چوروت (Chourrout) و همكاران در سال 1986 روش فوق را بر روی قزل آلای قهوه ای رنگ به كار برند با توجه به وجود DNA خارجی همراه با ملكولهای DNA میزبان پیشنهاد شده كه این ژن به داخل ژنوم ماهی وارد شده است. محققان به ورش دستی یا از طریق هضم آنزیمی از  جمله با تریپسن كوریون را برداشته و تزریق میكرواینجكشن انجام دادند. در همین سال اوزاتا (Ozata) ماهی كوچك مدوكا را به عنوان مدلی برای ترانسژنیك مطرح كرد. او پلاسمیدهای حاوی ژن كریستالین جوجه را به هسته تخم ها از طریق میكرواینجكشن وارد كرد. به علت كوریون سفت در تخم لقاح یافته تعدادی از ماهیان استفاده از میكرواینجكشن مشكل و مستلزم اتلاف وقت زیادی است. به همین منظور  روشهایی جهت غلبه بر این مشكل به كار گرفته شده است. از جمله در سال 1988 بریم (Brem)  و همكاران ژن هورمون رشد انسان را به كمك وكتور مناسب از طریق میكروپیل به صفحه زایای تخم های تیلاپیا تزریق كردند و رشد بچه ماهیان طی 90 روز بررسی شد. مشابه این تحقیق توسط فلت چر (Fletcher) و همكاران در همین سال بر روی ماهی آزاد اتلانتیك انجام شد. همچنین تكنیكهای دیگر شامل الكتروپورشن (Electroporation) شلیك ذرات ژن Shatagun بر روی تخمك و طراحی لیپوزوم جهت ورود به زرده تخم انجام شده است. میكر واینجكشن نیاز به مهارت زیادی دارد و از طرفی سرعت آن كم و هزینه و تجهیزات آن زیاد است و مستلزم زحمات و زمان زیادی برای ایجاد تعداد زیادی از ما هیان ترانسژنیك است علاوه بر این از دیگر مشكلات آن این است كه در تخم های القاح یافته اغلب ماهیان هسته به وسیله میكرسكوپ قابل روئیت نیست بنابراین DNA را به سیتو پلاسم  تزریق می كنند.

2-1- بیان ژن هورمون رشد ماهی در باكتریچ

هورمون رشد یك پلی پپتید تك زنجیره است كه به وسیله هیپوفیز پیشین تولید و ترشح می شود. در مهره داران اولین نقش هورمون رشد افزایش رشد سوماتیكی است علاوه بر این ماهیان استخوانی این هورمون در تنظیم شرایط اسمزی و تعادل الكترولیتی بدن و چندین عمل متابولیكی دیگر نقش دارد. ساختار ژن هورمون رشد و بیان آن، از مدلهای مهم برای مطالعه رابطه سا ختمان و عمل پروتئین و تنظیم بیان ژن است، طی تحقیقی كه سال 1993 توسط سونگ (Song) و همكارانش انجام شد جداسازی ژن هورمون رشد و تولید پلی پپتید آن به میزان بسیار زیاد در میكروارگانیسم ها بررسی شد. در سالهای اخیر در بسیاری از ماهیان این ژن از طریق cDNA كلون شده است.  از جمله در یكی از فعالیتهای تحقیقاتی ژن هورمون رشد ماهی آزاد چنوك (Chinook salmon) از این طریق جدا و به باكتری اشیرشیاكلی تزریق شده است (Song 1993) در این تكنیك ابتدا cDNA هورمون رشد و جدا و كلون شد. cDNA 2/1 كیلو جفت باز بوده و در ساختار pSGH₄ طراحی شد. سپس دو تا پروب الیگونكلئوتیدی و پرایمر برا‌ی آن ساخته شد.

طراحی پروبها و پرایمرها بر اساس ردیف اسیدهای امینه به روش باندهای فسفر دی استری روی فاز جامد انجام گرفت. پروب A بر اساس ردیف رزیدوهای 7-1 و پرب B بر اساس رزیدوهای 172-166 طراحی شدند و به وسیله الكتروفورز روی ژل اكریل آمید خالص گردیدند. همچنین طراحی پرایمرهای 1و2 بر اساس الگوی cDNA انجام شد. سپس آمپلی فیكاسیون ژن هورمون رشد به وسیله PCR انجام  و محصولات PCR به وسیله الكتروفورز روی ژل آگاروز چك و با اتانل رسوب داده شدند و در قدم بعدی پلاسمید لازم برای بیان ژن طراحی گردید. و ژن مدیفای شده cDNA هورمون رشد به وسیه آنزیمهای برش دهنده Bam HI , Eco RI برش به ناقل پلاسمیدی كه آن هم به وسیله همین آنزیمها برش شده بود منتقل شد.

سپس پلاسمید طراحی شده به باكتری Ecoli JM105 وارد گریدند نو تركیب به وسیله پروب نشانه گذاری شده A مشخص شدند. كلونهای كه ژن به آ‌نها وارد شده بود. به نام pmAK5 نامیده شدند. اگر چه جهت تأئید بیشتر مجدد این كلونها تحت اثر آنزیمهای برش دهنده قرار داده شدند و با پروب نشانه B هیربد شدند. سپس اشیرشیا كولی های Ecoli K12 – JM105 حاوی پلاسمید pmAK5 كه دارای ژن هورمون رشد بودند در محیط كشت YT كلون شدند. پس از انكوباسیون باكتریها با ایزوپروپیل دی تیوگالاكتو پیرانوزید (IPTG) برای مدت 4 ساعت در دمای 37 درجه، سلولها جدا و در بافر لایملی (Laemmli 1971) حل و با SDS-PAGE و كماسی بررسی شدند. نتایج نشان داد كه به طور تخمین میزان 10-6 درصد از مجموع تمام پروتئین سلولی در اشیرشیاكولی مربوط به ژن هومون رشد بوده است.

3-1- انتقال ژن به تخم ماهی از طریق میكروپیل با میكروپیپت

در سال 1998 بریم و همكاران در تحیقیقی ژن هورمون رشد انسان را از طریق میكروپیل به صفحه زایای ماهیان تیلاپیا انتقال دادند رشد ماهیان طی 90 روز بررسی شد. جهت تكثیر، تعداد 4 یا 5 ماهی ماده را در كنار یك ماهی نر قرار دادند به طوریكه در شرایط آ‌زمایشگاهی  تخمك گذاری ماهیان ماده انجام و با اسپرم لقاح شدند. تخم های لقاح یافته 10 دقیه پس از تخمك گذاری   در شرایط مصنوعی برداشته شدند. تمام تخم ها به انكو باتورهای ویژه با جریان آب و دمای  منتقل شدند و تا زمان دست كاری نگهداری گردیدند. تزریق به تخم ها در زمانهای 10 دقیقه و 24-21 و 43-40 ساعت پس از تخمك گذاری انجام شد. ساختار پلاسمیدی كه در انتقال ژن به تیلاپیا به كار گرفته شد بنام 1- pXGH در تصویر 4 نشان شده است. این پلاسمید دارای 31/9 كیلوباز شامل 35/2 كیلو باز از قطعه ای از BPV-1 كه دارای دو محل ویژه برش توسط آنزیمهای EcoRI , Bam H1 می باشد. تصویر 4- ساختمان پلاسمید pXGH-1 و جایگاههای مورد شناسایی آنزیمهای برش دهنده از طرف دیگر 46/2 كیلو باز آن از قطعه ای از پلاسمید pBR322 و 4 كیلو باز آن كه دارای دو محل ویژه برش توسط Eco RI در دو انتهای خود می باشد مربوط به پروموترمتالوتیونین موش mMTI و ژن هورمون رشد انسان ‌hGH كه به آن متصل كرده اند بوده است. اگر چه از این مقدار 8/1 كیلو باز آن مربوط به پروموترژن متالوتیونین موش و 7/1 كیلو باز آن مربوط به ژن ساختمانی هورمون رشد انسان بوده است. در ژن هورمون رشد نواحی اگزون و انترون و ترتیبات غیر قابل ترجه در  طراحی شده بود همچنین در سمت  ژن هورمون رشد انسان قطعه ای به اندازه 5/0 كیلو  از فاژ  طراحی شده كه دارای محلهای ویژه ای جهت برش توسط آنزیمهای برش دهنده بوده است. علاوه بر این برای قطعه ای از ژن hGH كه در اثر برش توسط دو آنزیم Bg1 II , Pvn II ایجاد می شود پروب طراحی شده بود تزریق در یك پتری دیش پر از آب به كمك استریومیكروسكوپ (Wild M8) و دو پیپت انجام شد. تخم ها به كمك یك میكروپیپت نگهدارنده كه سر آن به شكل فنجان طراحی شده بود مكش و تثبیت و از حركت آنها به طرفین جلوگیری شد. سپس به كمك میكروپیپت دوم به قطر 5 میكرومتر محلول حاوی DNA از طریق میكروپیل به صفحه زایای تخم ها تزریق شد. مقدار تقریبی 10⁶  كپی از DNA به كمك فشار هوا به هر تخم تزریق شده است. جزئیات تزریق و هچ تا مرحله 90 روز در جدول شماره 2 ذكر شده است.

فهرست مطالب

عنوان                                                                                                                            صفحه

بخش اول: دست كاریهای ژنی در ماهیان

مقدمه................................................................................................................

1-1- به كار گیری پروموتر از ژن ماهیان.....................................................

2-1- بیان ژن هورمون رشد ماهی در باكتری...............................................

3-1-  انتقال ژن به تخم ماهی از طریق میكروپیل با میكروپیپت.....................

4-1- انتقال ژن از طریق اسپرم با انكوبه كردن آن در سیستم بافری...........

5-1- انقال ژن از طریق اسپرم با الكتروپورشن در سیستم بافری................

6-1- انتقال ژن  به تخم ماهی از طریق الكتروپورش.....................................

7-1-  انتقال ژن به تخم ماهی از طریق میكروپیل با میكرواینجكشن..............

8-1- بررسی امكان وراثت ژن منتقل شده به نسل ها بعد.............................

بخش دوم : دست كاریهای كروموزومی در ماهیان

1-2- دست كاریهای جنسی.............................................................................

1-1-2- دست كاریهای جنسی با تكنیك ژینوژنز............................................

2-1-2- دست كاریهای مجموعه كروزومی به وسیله تكنیك اندروژنز..........

2-2- پلوئیدی...................................................................................................

1-2-2- تریپلوئیدی.........................................................................................

2-2-2- تتراپلوئیدی........................................................................................

بخش سوم: كلونینگ

مقدمه................................................................................................................

1-3- ایجاد كلون به وسیله دوژینوژنز متوالی................................................

2-3- كلون كردن به وسیله تركیبی از اندروژنز و ژینوژنز...........................

3-3- جابجایی هسته........................................................................................

4-3- جابجایی سلولهای سوماتیك جنینی به جنین دیگر.................................

5-3- دورگه گیری..........................................................................................

4- منابع............................................................................................................

برچسب ها : مقدمه‌ای بر بیوتكنولوژی انتقال ژن در ماهی , تحقیق مقدمه‌ای بر بیوتكنولوژی انتقال ژن در ماهی , پروژه مقدمه‌ای بر بیوتكنولوژی انتقال ژن در ماهی , مقاله مقدمه‌ای بر بیوتكنولوژی انتقال ژن در ماهی , دانلود تحقیق مقدمه‌ای بر بیوتكنولوژی انتقال ژن در ماهی , پروژه , پژوهش , مقاله , جزوه , تحقیق , دانلود پروژه , دانلود پژوهش , دانلود مقاله , دانلود جزوه , دانلود تحقیق